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1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一类具有抗肿瘤活性的 kras
‑
pdeδ蛋白蛋白相互作用(ppis)抑制剂及其药学上可接受的 盐类，以及制备方法，以及化合物抗肿瘤活性，可用于治疗kras依 赖型的相关癌症。
背景技术：
2.胰腺癌恶性程度极高，早期病程难以发现，是全球致死率最高 的实体瘤之一。kras基因的突变对胰腺癌的发生发展有重要的影 响。然而靶向kras蛋白的药物研发进展缓慢，先后有多种靶向 kras的药物在临床试验阶段失败。近期，kras
g12c
共价结合抑制 剂显示了优秀的治疗效果，但是kras基因在胰腺癌细胞系中主要 的突变形式为kras
g12d
，因此并没有给胰腺癌的治疗带来变革。
3.kras
‑
pdeδ蛋白
‑
蛋白相互作用是靶向kras蛋白的新靶点， 对kras依赖的肿瘤株有效，有望为胰腺癌提供新的治疗策略。小分 子抑制剂通过阻断两者的相互作用，抑制pdeδ蛋白对kras蛋白的 转运，干扰kras在细胞膜上的正确定位，从而实现对kras信号 通路的阻断。然而，现有的kras
‑
pdeδ小分子抑制剂存在代谢和选 择性等问题，因此需要进一步筛选发现全新结构类型的小分子抑制 剂，丰富抑制剂的结构类型，从而发现体内活性好，成药性佳的全新 小分子抑制剂。
技术实现要素：
4.1.要解决的技术问题
5.本发明的目的是为了解决现有技术中的问题，而提出的螺环哌啶 酮类衍生物。
6.2.技术方案
7.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
8.螺环哌啶酮类衍生物，
[0009][0010]
优选地，其中x是苯环、脂肪环或氢原子。
[0011]
优选地，其中r1表示：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、 异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基或正己基；三氟甲基、三 氟甲氧基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基或丁氧基；氢、腈基、 低级卤代烷基、低级烷基、低级羟基烷基、低级烷氧基、低级烷基氨 基、低级卤代烷基氨基、低级环烷基氨基、低级链炔基氨基、酰胺基、 低级环烷基酰胺基、低级酰胺基烷基、苯基或取代苯基、苄基或取代 苄基。
[0012]
优选地，r2表示：各类饱和烷基，包括但不限于甲基、乙基、丙 基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基或 正己基、环丙基及取代环丙基、环丁基及取代环
丁基、环戊基及取代 环戊基、环己基及取代环己基；优选为环丙甲基；氢、低级烷基、低 级卤代烷基、低级羟基烷基、苯环或取代苯环、苄基或取代苄基。
[0013]
优选地，所述的“低级”是指含1至6个碳原子的直链或支链饱和 脂肪烃基团；所述的环烷基是指含3至7个碳的环。
[0014]
优选地，上述通式的化合物药学上可接受的盐类是有机酸盐或无 机酸盐。所述的无机酸包括(但不限于)盐酸、硫酸、磷酸、二磷酸、 氢溴酸或硝酸等；所述的有机酸包括(但不限于)乙酸、马来酸、富 马酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、对甲苯磺酸、水杨酸或草酸等。
[0015]
本发明还提供了上述化合物的制备方法，该方法如下；
[0016]
scheme 1
[0017][0018]
reagent and conditions:(a)acoh,rt,2.5h；(b)98％h2so4,rt.,18h； (c)dmf
‑
dma,meoh,55℃,16h；(d)nabh4,meoh,rt.,2h；(e)h2, 20％pd(oh))2,meoh,rt.,overnight；(f)4
‑
chlorobutyryl chloride,tea, dcm,rt.,2h；(g)18,tea,ki,acetonitrile,90℃,24h.
[0019]
scheme 2
[0020][0021]
reagents and conditions:(h)mgso4,nabh4,meoh,rt.,overnight；(i)γ
‑
butyro
‑ꢀ
lactone,trimethylaluminum,toluene,80℃,12h；(j)dmp,dcm,rt.,2h；(k)18, mgso4,nabh4,meoh,rt.,overnight.
[0022]
具体步骤
[0023]
化合物23系列的制备
[0024]
a.化合物14的制备
[0025]
苯胺、1
‑
苄基哌啶
‑4‑
酮、三甲基硅乙腈置于冰醋酸中常温反应4 小时，得目标中间体。
[0026]
b.化合物15的制备
[0027]
中间体14在浓硫酸中常温反应18小时，经氨水淬灭后得目标产 物。
[0028]
c.化合物16系列的制备
[0029]
以甲醇做溶剂，将化合物15、dma在55℃下反应16小时得目 标产物。
[0030]
d.化合物17
‑
18系列的制备
[0031]
以甲醇做溶剂，用nabh4常温下还原化合物16反应2小时得中间 体17，在20％pd(oh)2和氢气催化下脱去苄基得目标产物。
[0032]
化合物23系列的制备
[0033]
a.化合物22a
‑
22e制备
[0034]
不同的伯胺和4
‑
氯丁酰氯反应，以三乙胺为缚酸剂，二氯甲烷为 溶剂，常温下反应得化合物22a
‑
22e。
[0035]
b.化合物23a
‑
23e制备
[0036]
以乙腈为溶剂，将中间体22a、18和碘化钾在90℃油浴中回流反 应。2小时后再次加入22a，并继续反应24小时得目标产物。
[0037]
化合物g系列的制备
[0038]
以取代的醛31和苯胺通过还原氨化反应制得仲胺中间体33，随后 33与丁内酯反应得到伯醇中间体34，经戴斯马丁试剂氧化得到化 合物35，最后，中间体35和18经还原氨化反应制得36系列化合 物。
[0039]
本发明的化合物可进一步制备药学上可接受的盐。
[0040]
本发明的化合物可通过手性柱拆分的方法制备d
‑
型或l
‑
型异构体。
[0041]
本发明的第三方面，是提供了上述一类螺环哌啶酮衍生物，包括 消旋体、d
‑
型或l
‑
型异构体、及其在药学上可接受的盐在kras
‑
pdeδ 蛋白蛋白相互作用抑制剂方面的应用。将目标产物进行pdeδ蛋白亲 和力的测试。测试方法采用荧光偏振法。具体实验方法和实验结果 参照实施例x。
[0042]
本发明还提供了上述的一类螺环哌啶酮衍生物，包括其消旋体、 d
‑
型或l
‑
型异构体，及其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应 用。
[0043]
所述的肿瘤为kras依赖型肿瘤珠，如胰腺癌等。
[0044]
(1)对本发明的化合物进行了肿瘤细胞增殖抑制试验，试验方 法采用常规的cck8法,细胞株选用miapaca
‑
2(人胰腺导管癌细胞)。 培养液为dmem+10％fbs+2.5％hs+双抗。以上实验结果表明，本发 明的化合物具有良好的抗肿瘤活性，部分化合物的抗肿瘤活性优于阳 性药，同时表现出kras依赖型肿瘤珠的选择性。因此本发明化合物 及其盐类可以用于制备抗肿瘤药物。
附图说明
[0045]
图1为化合物36l在小鼠胰腺癌pdx模型中的体内药效结果。
具体实施方式
[0046]
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不 仅限于此。本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。
[0047]
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[0048]
以下实施例所涉化合物对应通式ⅰ的化学结构式、1h
‑
nmr和ms 数据详见表1。
[0049]
表1：本发明部分优选化合物的1h
‑
nmr和ms数据
[0050]
[0051]
[0052]
[0053]
[0054]
[0055]
[0056][0057]
实施例1：1
‑
苄基
‑4‑
(苯氨基)哌啶
‑4‑
腈(14)
[0058]
称取化合物11(3.0g,15.8mmol)和12(1.48g,15.8mmol)溶 于20ml冰醋酸，而后转移至冰浴，冷却后缓慢滴加化合物13(4.7 g,47.4mmol)。加入完毕转移至常温反应。4小时后反应结束，加入 2n naoh溶液淬灭反应，并调节ph至10。而后dcm萃取(30 ml
×
3)，合并有机相并用饱和食盐水洗涤后旋干并用乙醚打浆得产 物。白色固体，2.8g，收率60.9％。
[0059]
实施例2：1
‑
苄基
‑4‑
(苯氨基)哌啶
‑4‑
羧酰胺(15)
[0060]
称取化合物14(2.8g,9.6mmol)溶于14ml浓硫酸，而后常温反应。18小 时后反应结束，将反应液逐滴加入冰浴的25％氨水溶液80ml，加入完毕调节ph 至10以上。过滤，保留固体并烘干，而后甲醇打浆得产物。白色固体，2.2g， 收率94.2％。
[0061]
实施例3：1
‑
苄基
‑4‑
(苯氨基)哌啶
‑4‑
羧酰胺(16)
[0062]
称取化合物15(2.16g,7mmol)溶于15ml甲醇，超声助溶后转移至55℃下 搅拌，缓慢滴加dma(2.5g,21mmol)，之后继续在55℃下反应。16小时停 止反应并旋干反应液，粗品用乙醚打浆得产物。白色固体，1.53g，收率68.6％。
[0063]
实施例4：1
‑
苯基
‑
1,3,8
‑
三氮螺环[4.5]癸
‑4‑
酮(18)
[0064]
称取化合物16(1.5g,4.76mmol)溶于25ml甲醇，超声助溶后转移至冰 浴下搅拌，缓慢加入nabh4(0.23g,5.95mmol)，之后在常温下反应。4小时停 止反应并加水1ml淬灭反应。旋干反应液，粗品用dcm 50ml溶解并用水(20 ml
×
2)洗涤。保留有机相，减压除去溶剂得17。化合物17用30ml甲醇溶解， 滴加少量甲酸，加入20％pd(oh)2(0.3g,20％)并在氢气保护下常温反应。48 小时后停止反应并用硅藻土过滤，保留滤液，加入硅胶拌样并用柱层析纯化 (dcm:meoh＝100:7,含0.1％tea)。白色固体，0.65g，收率59.1％。
[0065]
实施例5：4
‑
氯
‑
n
‑
苯基丁酰胺(22a)
[0066]
将原料苯胺21a(470mg,1eq,5mmol)、tea(850mg,1.2eq,6mmol)溶 于20ml dcm，冰水浴下逐滴加入4
‑
氯丁酰氯(1.01g,2eq,10mmol)，之后常 温反应。2小时后加水淬灭并用饱和na2co3溶液洗涤，保留有机相并旋干得粗 品。快速柱色谱纯化(pe:ea＝75:25)得产物。化合物22b
‑
22e合成参考中间 体22a的合成方法。
[0067]
实施例6：4
‑
(4
‑
氧
‑1‑
苯基
‑
1,3,8
‑
三氮杂螺[4.5]癸
‑
8基)
‑
n
‑
苯基丁酰胺(23a)
[0068]
将中间体22a(400mg,2eq,2mmol)、18(230mg,1eq,1mmol)和碘化钾 (17mg,0.1eq,0.1mmol)溶于10ml乙腈，而反应瓶置于90℃油浴中回流反 应。2小时后再次加入22a(200mg,1eq,1mmol)并继续反应24小时。反应结 束后，将反应液倒入清水20ml并加入乙酸乙酯(30ml
×
3)萃取。合并有机 相，饱和nacl溶液洗涤后并旋干得粗品。快速柱色谱纯化(dcm:meoh＝ 100:7)得目标产物。化合物23b
‑
23e合成参考中间体22a的合成方法。
[0069]
实施例7：n
‑
(2
‑
氟苄基)
‑4‑
羟基
‑
n
‑
苯基丁酰胺(34a)
[0070]
将仲胺33a(600mg,1eq,3mmol)溶于干燥的甲苯10ml，而后体系密闭 并用氮气保护。冰浴下缓慢加入三甲基铝的甲苯溶液(2m in toluene,2eq,3 ml)，加入完毕在常温下活化2小时。取γ
‑
丁内酯(510mg,2eq,6mmol)加入 上述反应体系并将反应瓶转移至65℃反应24小时。反应结束后，转移至冰浴 并加入甲醇、饱和酒石酸钾钠溶液淬灭反应。反应体系缓慢倒入乙酸乙酯溶液， 有机相依次用清水、饱和食盐水洗涤。保留有机相，旋干得粗品。快速柱色谱纯 化(pe:ea＝40:60～0:100)得中间体34a。34b
‑
34o均按此法制得。
[0071]
实施例8：n
‑
(2
‑
氟苄基)
‑4‑
氧代
‑
n
‑
苯基丁酰胺(35a)
[0072]
取伯醇34a(145mg,1eq,0.5mmol)溶于干燥的dcm 15ml，冰浴下缓慢 加入戴斯马丁试剂(425mg,2eq,1mmol)，加入完毕转移至常温下反应1小时。 反应结束后，加入饱和硫代硫酸钠溶液和饱和na2co3溶液淬灭反应。水相用 dcm(10ml
×
3)洗涤。合并有机相并旋干得粗品。快速柱色谱纯化(pe:ea ＝75:25)得中间体35a。35b
‑
35o的制备参照35a的合成路线。
[0073]
实施例9：n
‑
(2
‑
氟苄基)
‑4‑
(4
‑
氧代
‑1‑
苯基
‑
1,3,8
‑
三氮杂螺[4.5]癸
‑
8基)
‑
n
‑
苯基 丁酰胺(36a)
[0074]
取中间体35a(142mg,1eq,0.5mmol)、18(115mg,1eq,0.5mmol)和无 水mgso4(300mg,2.5mmol)置于25ml圆底烧瓶，加入甲醇10ml溶解并在 常温反应过夜。冰浴下缓慢加入nabh4(12mg,0.3mmol)，而后转移至常温反 应2小时。反应结束，加入清水淬灭反应并用硅藻土过滤。旋干滤液得产物粗 品。c18快速柱色谱纯化(h2o(0.1％tfa):meoh＝40:60～80:20)得目标产物。 终产物36b
‑
36o参照36a的合成方法制备纯化。
[0075]
实施例10：本发明化合物荧光偏振法测定kras
‑
pdeδ蛋白结合抑 制活性
[0076]
实验材料：
[0077]
阿托伐他汀荧光探针(atrovastatin
‑
peg3
‑
fitc)，缓冲液(0.1 m pbs,0.05％chaps,0.5％dmso)，pdeδ蛋白，黑色96孔板
[0078]
1.fitc探针与pdeδ蛋白的结合常数测定
[0079]
a.取黑色96孔板1块，平衡至室温；
[0080]
b.用缓冲液将阿托伐他汀荧光探针稀释至100nm；
[0081]
c.用缓冲液稀释pdeδ蛋白，蛋白浓度依次为1000nm、500nm、 250nm、125nm、62.5nm、31.25nm、15.63nm、7.81nm、3.90 nm、1.85nm；
[0082]
d.三复孔测量，在96孔板中1
‑
10孔依次加入配好的pdeδ蛋白 溶液50ul，1
‑
11孔中加入稀释的探针溶液50ul(11孔为空白对照，) 用缓冲液补充每孔溶液体积至200ul，加毕30℃下避光孵育2小 时；
[0083]
e.用biotek synergy h2酶标仪读取荧光各向异性值(激发波长： 485，检测波长535)，探针与pdeδ蛋白的结合常数根据荧光各向异 性值的非线性回归拟合得到mathamatica 9(wolfram research inc.)， 公式如下：
[0084][0085][0086]
公式中，f为荧光探针(atrovastatin
‑
peg3
‑
fitc)结合比例，a 为荧光偏振各向异性测量值，q值是指探针与浓度最高组蛋白结合的 荧光强度同自由状态的荧光强度的比值，a
b
值为结合状态下的探针 各向异性值，a
f
值为自由状态下的探针的各向异性值，l
st
为荧光探 针浓度，rt为蛋白浓度，k
d1
为fitc探针的蛋白结合常数。
[0087]
根据曲线确定测量化合物结合常数时选定的蛋白浓度为160 nm，探针浓度为100nm
[0088]
2.化合物与pdeδ蛋白的结合常数测定
[0089]
a.取黑色96孔板1块，平衡至室温；
[0090]
b.用缓冲液分别将阿托伐他汀荧光探针和pdeδ蛋白稀释至100 nm和160nm；
[0091]
c.用dmso溶解化合物，并用含0.2％tween
‑
80的缓冲液稀释化 合物浓度依次为10um、5um、2.5um、1.25um、0.625um、312.5 nm、156.3nm、78.12nm、39.1nm、19.5nm；
[0092]
d.三复孔测量，在96孔板中1
‑
1孔依次加入pdeδ蛋白溶液50 ul，1
‑
12孔中加入fitc探针溶液50ul，1
‑
10孔分别加入配好的化 合物溶液100ul，其余孔用缓冲液补充每孔溶液体积至200ul，加 毕30℃下避光孵育10小时；
[0093]
e.用biotek synergy h2酶标仪读取荧光各向异性值(激发波长： 485，检测波长535)，化合物与蛋白的结合常数根据荧光各向异性 值的非线性回归拟合得到mathamatica 9(wolfram research inc.)，公 式如下：
[0094]
d＝k
d1
+k
d2
+l
st
+l
t
‑
r
t
；
[0095]
e＝(l
t
‑
r
t
)
×
k
d1
+(l
st
‑
r
t
)
×
k
d2
+k
d1
×
k
d2
；
[0096]
f＝
‑
k
d1
×
k
d2
×
r
t
；
[0097][0098][0099][0100]
公式中，f为荧光探针(atrovastatin
‑
peg3
‑
fitc)结合比例，a 为荧光偏振各向异性测量值，q值是指探针与浓度最高组蛋白结合的 荧光强度同自由状态的荧光强度的比值，a
b
值为结合状态下的探针 各向异性值，a
f
值为自由状态下的探针的各向异性值，l
st
为荧光探 针浓度，rt为蛋白浓度，k
d1
为fitc探针的蛋白结合常数，k
d2
为 化合物的蛋白结合抑制常数。
[0101]
实施例11：本发明化合物体外抗肿瘤活性测试：
[0102]
1、试验细胞株
[0103]
mia paca
‑
2(人胰腺癌细胞)，购自中科院上海生化细胞所。
[0104]
培养液为dmem+10％fbs+2.5％hs+双抗。
[0105]
2、仪器
[0106]
5％co2培养箱、96孔板(whb)、biotek synergy h2酶标仪
[0107]
3、试验方法
[0108]
受试化合物样品液配制：用dmso(merck)溶解后，加入含fbs 的培养基溶液配成100μm的溶液或均匀的混悬液，然后用 0.1％dmso的培养基稀释，最终浓度分别为100μm、33.3μm、11.1 μm、3.70μm、1.23μm、0.41μm。
[0109]
将文献报道的kras
‑
pdeδ抑制剂deltazinone(dz)以同样的条 件配成对照品溶液。
[0110]
本实验方法采用的是cck8法。为96孔板每孔加入浓度为7
×
104个/ml的细胞悬液100μl，即5000个细胞/孔，置37℃、5％co2培 养箱内。24小时后，去除上层培养液，分别加入受试化合物样品液 和对照品液，100μl孔，37℃作用72小时。每孔加入10mg/ml的 cck8(2
‑
(2
‑
甲氧基
‑4‑
硝苯基)
‑3‑
(4
‑
硝苯基)
‑5‑
(2,4
‑
二磺基苯)
‑
2h
‑
四唑 单钠盐)溶液10μl，作用2小时后用酶标仪测570nm od值，计算 半数抑制浓度ic
50
。
[0111]
抑制率＝(空白对照孔od值
‑
给药孔od值)/空白对照孔od值
ꢀ×
100％。根据各个浓度的ic％值，用graphpad软件进行非线性回归， 算出各化合物抑制50％细胞生长的浓度，即ic
50
。
[0112]
化合物的抗肿瘤活性详见下表，其中，样品是指相应实施例中制 备的二氢喹唑啉酮类化合物。
[0113]
阳性药选取文献报道的kras
‑
pdeδ抑制剂deltazinone(dz)作 为对照。
[0114][0115]
体外抗肿瘤实验结果显示，大部分化合物表现对kras依赖型肿 瘤株有较强的抑制活性特点，部分发明的化合物结果优于对照药 deltazinone。
[0116]
实施例12：本发明化合物在裸鼠胰腺癌pdx模型中显著抑制肿瘤生 长：
[0117]
利用胰腺癌的pdx模型进一步评价36l的体内药效。基于此，首 先筛选敏感临床原代细胞系。选择4种不同的原代胰腺癌细胞株进 行筛选，分别为0001、0037、0034和0043。以cck8法分别测定细 胞在不同浓度的36l作用后生长曲线。化合物36l能够呈浓度依赖地 抑制原代细胞的生长，且对0001、0037及0034的抑制作用较0043 细胞株更为敏感。相比之下，阳性对照2对4株细胞系均没有显著的 抑制活性
[0118]
根据原代细胞的体外抗肿瘤活性结果，选择敏感细胞株0034进行 pdx模型的构建。在肿瘤体积至100mm3左右开始给药。化合物36l 按照50mg/kg的剂量，腹腔给药，一天给药一次。鉴于化合物2体 内代谢稳定性差，阳性对照选择胰腺癌的一线药物吉西他滨，按10 mg/kg的剂量尾静脉给药，每三天给药一次。实验结果(图1a
‑
c) 表明，化合物36l显著抑制pdx肿瘤的生长，其抑瘤率达到57.3％。 从肿瘤重量和体积变化来看，药物组和空白组有显著的差异(p< 0.05。)尽管化合物36l的抑瘤率不如吉西他滨，但36l是现有的kras
‑ꢀ
pdeδ抑制剂中抑瘤率最高的，而且也是在胰腺癌pdx模型中唯一有 效的kras
‑
pdeδ抑制剂。这个结果进一步验证kras
‑
pdeδ相互作 用的成药潜力，对发掘kras
‑
pdeδ抑制剂的临床应用具有十分重要 的意义。
[0119]
为进一步验证药物对肿瘤组织的作用，将体内实验的pdx肿瘤 制成组织切片，并进行染色分析。首先用苏木素
‑
伊红染色 (hematoxylin and eosin stain,h&e stain)来评价肿瘤组织的病理学变 化。如图1所示，36l组与和空白组相比，肿瘤组织中有明显的透明 质变增多的现象，证明化合物36l在体内诱导肿瘤细胞的老化和死亡。 进一步用ki
‑
67免疫组化染色检测肿瘤组织中增殖细胞的数量，以评 价不同组肿瘤增殖能力的强弱。结果显示(图1d
‑
e)，36l的用药组 的肿瘤切片中能够明显增殖细胞数量的减少，而吉西他滨组的肿瘤切 片也能观察到同样的抑制作用。组织切片染色结果进一步证明化合 物36l能够在体内显著抑制胰腺癌的增殖。
[0120]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并 不局限于
此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范 围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都 应涵盖在本发明的保护范围之内。